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  SDS-CN-EG24502-LightNing® ScaI

相關(guān)問(wèn)答

• Q:

  為什么在CutOne® Buffer中加入HSA？

  A:

  一些酶在反應(yīng)過(guò)程中需要HSA的參與，我們?cè)贑utOne® Buffer中添加了HSA，避免反應(yīng)中額外添加組分，使得酶切反應(yīng)更加便捷。

• Q:

  HSA的添加對(duì)于雷霆系列限制性?xún)?nèi)切酶的功能會(huì)產(chǎn)生什么樣的影響？

  A:

  在我們的測(cè)試中未曾發(fā)現(xiàn)HSA對(duì)于雷霆系列限制性?xún)?nèi)切酶的功能有任何影響。在有些情況下，對(duì)于部分的酶切反應(yīng)有促進(jìn)作用。

• Q:

  為了保證酶量小于體系的1/10多酶切時(shí)往往可加入酶量較少，從而導(dǎo)致酶切不完全，如何解決？

  A:

  說(shuō)明書(shū)中給出的是最佳反應(yīng)體系，可以根據(jù)具體需求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

  酶切不完全的問(wèn)題可以從這幾個(gè)方面進(jìn)行解決：降低底物濃度，提高酶量同時(shí)擴(kuò)大反應(yīng)體系，或者適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。

• Q:

  我需要嚴(yán)格遵守5~15 min的酶切時(shí)間嗎？能夠延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間嗎？

  A:

  雷霆系列限制性?xún)?nèi)切酶經(jīng)過(guò)改造可以將酶切時(shí)間縮短至5~15 min。同樣也消除了限制性?xún)?nèi)切酶的星活性（長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)造成的非特異性消化），在說(shuō)明書(shū)中告知的星活性出現(xiàn)的時(shí)間范圍內(nèi)可以適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。

• Q:

  酶切反應(yīng)完成后終止反應(yīng)是不是必要的？我該如何終止我的酶切反應(yīng)

  A:

  限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)于下游反應(yīng)（連接與轉(zhuǎn)化等）有影響，部分限制性?xún)?nèi)切酶能與雙鏈DNA結(jié)合，對(duì)于凝膠電泳會(huì)產(chǎn)生影響；而且不失活酶切產(chǎn)物不能保存。故反應(yīng)完成后應(yīng)對(duì)其進(jìn)行失活處理。常規(guī)失活方式為高溫?zé)崾Щ睿瑢?duì)應(yīng)各個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶的失活溫度請(qǐng)查閱說(shuō)明書(shū)。另，部分上樣染料中含有SDS可使蛋白變性，苯酚或氯仿的萃取也能使反應(yīng)終止。

• Q:

  我什么時(shí)候應(yīng)當(dāng)考慮星活性對(duì)于酶切反應(yīng)的影響？

  A:

  如果額外的酶切條帶對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生影響時(shí)我們應(yīng)當(dāng)考慮星活性對(duì)于酶切反應(yīng)的影響。例如：進(jìn)行基因型、突變型分析或克隆時(shí)我們應(yīng)當(dāng)避免星活性的產(chǎn)生。避免星活性的有效方法：適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體積（較小的反應(yīng)體積容易造成甘油體積達(dá)到或超過(guò)總反應(yīng)體積的5%）；不進(jìn)行超長(zhǎng)時(shí)間孵育（過(guò)夜消化極易產(chǎn)生星活性）。

• Q:

  酶切反應(yīng)的具體操作流程是怎樣的？

  A:

  大部分的科研工作者通常遵循如下流程：1 U限制性?xún)?nèi)切酶可以完全酶切1μg經(jīng)過(guò)純化的DNA，總體積為20 μl于1×CutOneTM Buffer環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)。為防止總酶量超過(guò)總體積的10%，在雙酶切時(shí)可以適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體系。千萬(wàn)不要孵育超過(guò)星活性出現(xiàn)的時(shí)間（星活性出現(xiàn)時(shí)間請(qǐng)查閱各酶說(shuō)明書(shū)）。另外一個(gè)容易被忽略的問(wèn)題對(duì)于酶切的影響也非常大，在反應(yīng)體系配制完成后完全的混勻才能反應(yīng)完全，推薦用槍頭輕輕吹打3到5次或用手指輕彈管壁，之后用離心機(jī)瞬離即可。不要渦旋反應(yīng)體系，劇烈震蕩對(duì)酶的活性有極大的影響。

• Q:

  酶切反應(yīng)完成后，沒(méi)有看到切割后的跡象，有哪些因素可能對(duì)酶切產(chǎn)生抑制作用？

  A:

  作為酶切反應(yīng)底物的DNA應(yīng)該是純凈的沒(méi)有污染的，其中例如：苯酚、氯仿、酒精、EDTA、去污劑、過(guò)量的鹽都會(huì)抑制酶切反應(yīng)。部分酶對(duì)于DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)較為敏感，DNA的缺刻、超螺旋都會(huì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生影響。另外很多限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)于DNA的甲基化非常敏感，確保DNA的甲基化類(lèi)型不會(huì)阻止限制性?xún)?nèi)切酶的反應(yīng)。如果找不到您的酶切反應(yīng)不能進(jìn)行的原因，我們推薦對(duì)照DNA底物（有多個(gè)酶切位點(diǎn)的DNA底物例如lambda DNA），進(jìn)行對(duì)比反應(yīng)。如果對(duì)照DNA底物能夠被切開(kāi)而您的底物仍舊不能被切開(kāi)，將兩種DNA底物進(jìn)行混合，進(jìn)一步確保DNA底物中不存在能夠抑制限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng)的物質(zhì)。

• Q:

  超長(zhǎng)時(shí)間的孵育（孵育時(shí)間超過(guò)1 h）對(duì)于酶切是否存在影響？

  A:

  雷霆系列限制性?xún)?nèi)切酶的酶活定義是以15 min反應(yīng)時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)的。增加反應(yīng)時(shí)間應(yīng)該對(duì)應(yīng)著減少酶的用量，值得注意的是不同的DNA底物對(duì)于酶的需求量是不一樣的。為了使DNA底物反應(yīng)完全同時(shí)避免非特異切割，使用前一定要仔細(xì)查閱酶的反應(yīng)濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、星活性出現(xiàn)時(shí)間等。

• Q:

  限制性?xún)?nèi)切酶簡(jiǎn)并性識(shí)別位點(diǎn)一定是回文的嗎？

  A:

  大多數(shù)二型限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別序列是回文的，而且是特定的堿基序列。然而有些限制性?xún)?nèi)切酶具有簡(jiǎn)并性識(shí)別位點(diǎn)，也就是說(shuō)識(shí)別位點(diǎn)中有一個(gè)或以上的堿基對(duì)是非特異的（例如：BsrfI識(shí)別5’RCCGGY, R=A/G, Y=C/T）。對(duì)于這樣的具有簡(jiǎn)并性識(shí)別位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶，只要是符合要求的序列皆能被識(shí)別并且被正確地切割（例如5’ ACCGGC, 5’ ACCGGT, 5’ GCCGGC, 和5’ GCCGGT，其中兩個(gè)并不是回文的，仍然能被BsrFI識(shí)別并且切割）。

• Q:

  雷霆系列限制性?xún)?nèi)切酶的穩(wěn)定性如何？運(yùn)輸過(guò)程中凍融會(huì)對(duì)酶的活力產(chǎn)生影響嗎？

  A:

  運(yùn)輸過(guò)程中以干冰保持低溫運(yùn)輸，酶有結(jié)冰的可能，但是這對(duì)于雷霆系列的限制性?xún)?nèi)切酶的質(zhì)量沒(méi)有影響，我們對(duì)所有的酶都進(jìn)行了至少三次的凍融實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果表示，酶的活性仍舊是100%。您收到的酶可能是冰袋運(yùn)輸?shù)模?qǐng)不要擔(dān)心，這僅僅是由當(dāng)?shù)氐慕?jīng)銷(xiāo)商運(yùn)到您的實(shí)驗(yàn)室過(guò)程中采取的運(yùn)輸方案，我們經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的檢測(cè)，暴露在4℃下經(jīng)過(guò)24~48 h后仍然不受影響。

• Q:

  除了高溫還有什么方法能夠讓雷霆系列限制性?xún)?nèi)切酶失活？（也不想用苯酚或氯仿）

  A:

  可以使用EDTA終止反應(yīng)，或者以SDS等蛋白質(zhì)變性劑使得酶變性。如果酶切產(chǎn)物還要用于下游實(shí)驗(yàn)?zāi)敲纯梢杂媚z回收試劑盒進(jìn)行DNA清潔，回收后酶切反應(yīng)就被終止了。

• Q:

  酶切反應(yīng)完成后跑凝膠電泳，結(jié)果條帶與預(yù)期不符，可能原因有哪些？

  A:

  可能原因有如下幾個(gè)：

  　　•　限制性?xún)?nèi)切酶表現(xiàn)出星活性：確保酶切反應(yīng)是嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)推薦的步驟進(jìn)行的。如果是由星活性引起的那么有以下幾個(gè)解決方法：①減少反應(yīng)時(shí)間；②增加反應(yīng)體系的體積；③減少反應(yīng)中酶的含量。

  　　•　酶切不完全（一個(gè)或多個(gè)酶切位點(diǎn)有部分DNA底物未被切開(kāi)），可以嘗試加多酶量或者延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。如果上面的嘗試不能很好地解決問(wèn)題，請(qǐng)從DNA底物上尋找解決方案，DNA底物中是否含有酶切反應(yīng)抑制劑，將DNA純化后再進(jìn)行反應(yīng)；DNA是否被甲基化，胞內(nèi)的甲基化系統(tǒng)能夠使DNA的特定堿基發(fā)生甲基化，而這些甲基化的堿基對(duì)于酶切反應(yīng)有著不同程度的抑制。

  　　•　被未知限制性?xún)?nèi)切酶污染：未知的限制性?xún)?nèi)切酶可能通過(guò)不當(dāng)?shù)牟僮鳌⒉患儍舻腄NA底物、不潔凈的管子等途徑摻入酶切反應(yīng)中。

• Q:

  有哪些關(guān)鍵因素會(huì)導(dǎo)致星活性？

  A:

  長(zhǎng)時(shí)間孵育、過(guò)量的酶、高甘油含量（通常高于5%）、較小的反應(yīng)體系等因素都會(huì)導(dǎo)致星活性的產(chǎn)生。

• Q:

  未經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物直接酶切要怎樣設(shè)定體系？

  A:

  反應(yīng)體系推薦由這些內(nèi)容組成：10 μl PCR產(chǎn)物、2 μl 10×CutOneTM Buffer、1~2 μl相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶、ddH2O補(bǔ)齊到30 μl。酶的用量根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度而定，只加入2 μl反應(yīng)緩沖液的原因是PCR反應(yīng)中存在對(duì)應(yīng)的鹽離子和金屬離子，適當(dāng)減少反應(yīng)緩沖液的用量以保證最終反應(yīng)體系中的環(huán)境適宜限制性?xún)?nèi)切酶發(fā)揮功能。

• Q:

  雷霆系列限制性?xún)?nèi)切酶的活力定義是怎樣的？

  A:

  雷霆系列限制性?xún)?nèi)切酶1 U的定義是正好在15 min于20 μl的反應(yīng)總體系中將1 μg的 DNA底物在1×反應(yīng)緩沖液的環(huán)境中完全消化所需求的酶量。

• Q:

  雷霆系列限制性?xún)?nèi)切酶的活力單位與Thermo Fisher的活力單位或者 NEB的活力單位應(yīng)該如何換算？

  A:

  由于反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)體系不同，活力單位無(wú)法直接換算。雷霆系列限制性?xún)?nèi)切酶活力單位是依據(jù)反應(yīng)進(jìn)行定義的，正好在15 min于20 μl的反應(yīng)總體系中將1 μg的 DNA底物在1×反應(yīng)緩沖液的環(huán)境中完全消化所需求的酶量為1 U，也就是說(shuō)反應(yīng)中加入與DNA底物成比例的酶量即可完成反應(yīng)。