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  SDS-CN-EG15586-LightNing™ FspI

相關問答

• Q:

  為什么在CutOne® Buffer中加入HSA？

  A:

  一些酶在反應過程中需要HSA的參與，我們在CutOne® Buffer中添加了HSA，避免反應中額外添加組分，使得酶切反應更加便捷。

• Q:

  HSA的添加對于雷霆系列限制性內切酶的功能會產生什么樣的影響？

  A:

  在我們的測試中未曾發現HSA對于雷霆系列限制性內切酶的功能有任何影響。在有些情況下，對于部分的酶切反應有促進作用。

• Q:

  為了保證酶量小于體系的1/10多酶切時往往可加入酶量較少，從而導致酶切不完全，如何解決？

  A:

  說明書中給出的是最佳反應體系，可以根據具體需求進行適當調整。

  酶切不完全的問題可以從這幾個方面進行解決：降低底物濃度，提高酶量同時擴大反應體系，或者適當延長反應時間。

• Q:

  我需要嚴格遵守5~15 min的酶切時間嗎？能夠延長反應時間嗎？

  A:

  雷霆系列限制性內切酶經過改造可以將酶切時間縮短至5~15 min。同樣也消除了限制性內切酶的星活性（長時間反應造成的非特異性消化），在說明書中告知的星活性出現的時間范圍內可以適當延長反應時間。

• Q:

  酶切反應完成后終止反應是不是必要的？我該如何終止我的酶切反應

  A:

  限制性內切酶對于下游反應（連接與轉化等）有影響，部分限制性內切酶能與雙鏈DNA結合，對于凝膠電泳會產生影響；而且不失活酶切產物不能保存。故反應完成后應對其進行失活處理。常規失活方式為高溫熱失活，對應各個限制性內切酶的失活溫度請查閱說明書。另，部分上樣染料中含有SDS可使蛋白變性，苯酚或氯仿的萃取也能使反應終止。

• Q:

  我什么時候應當考慮星活性對于酶切反應的影響？

  A:

  如果額外的酶切條帶對于實驗結果會產生影響時我們應當考慮星活性對于酶切反應的影響。例如：進行基因型、突變型分析或克隆時我們應當避免星活性的產生。避免星活性的有效方法：適當擴大反應體積（較小的反應體積容易造成甘油體積達到或超過總反應體積的5%）；不進行超長時間孵育（過夜消化極易產生星活性）。

• Q:

  酶切反應的具體操作流程是怎樣的？

  A:

  大部分的科研工作者通常遵循如下流程：1 U限制性內切酶可以完全酶切1μg經過純化的DNA，總體積為20 μl于1×CutOneTM Buffer環境下進行反應。為防止總酶量超過總體積的10%，在雙酶切時可以適當擴大反應體系。千萬不要孵育超過星活性出現的時間（星活性出現時間請查閱各酶說明書）。另外一個容易被忽略的問題對于酶切的影響也非常大，在反應體系配制完成后完全的混勻才能反應完全，推薦用槍頭輕輕吹打3到5次或用手指輕彈管壁，之后用離心機瞬離即可。不要渦旋反應體系，劇烈震蕩對酶的活性有極大的影響。

• Q:

  酶切反應完成后，沒有看到切割后的跡象，有哪些因素可能對酶切產生抑制作用？

  A:

  作為酶切反應底物的DNA應該是純凈的沒有污染的，其中例如：苯酚、氯仿、酒精、EDTA、去污劑、過量的鹽都會抑制酶切反應。部分酶對于DNA的二級結構較為敏感，DNA的缺刻、超螺旋都會對反應產生影響。另外很多限制性內切酶對于DNA的甲基化非常敏感，確保DNA的甲基化類型不會阻止限制性內切酶的反應。如果找不到您的酶切反應不能進行的原因，我們推薦對照DNA底物（有多個酶切位點的DNA底物例如lambda DNA），進行對比反應。如果對照DNA底物能夠被切開而您的底物仍舊不能被切開，將兩種DNA底物進行混合，進一步確保DNA底物中不存在能夠抑制限制性內切酶反應的物質。

• Q:

  超長時間的孵育（孵育時間超過1 h）對于酶切是否存在影響？

  A:

  雷霆系列限制性內切酶的酶活定義是以15 min反應時間為標準的。增加反應時間應該對應著減少酶的用量，值得注意的是不同的DNA底物對于酶的需求量是不一樣的。為了使DNA底物反應完全同時避免非特異切割，使用前一定要仔細查閱酶的反應濃度、反應溫度、反應時間、星活性出現時間等。

• Q:

  限制性內切酶簡并性識別位點一定是回文的嗎？

  A:

  大多數二型限制性內切酶的識別序列是回文的，而且是特定的堿基序列。然而有些限制性內切酶具有簡并性識別位點，也就是說識別位點中有一個或以上的堿基對是非特異的（例如：BsrfI識別5’RCCGGY, R=A/G, Y=C/T）。對于這樣的具有簡并性識別位點的限制性內切酶，只要是符合要求的序列皆能被識別并且被正確地切割（例如5’ ACCGGC, 5’ ACCGGT, 5’ GCCGGC, 和5’ GCCGGT，其中兩個并不是回文的，仍然能被BsrFI識別并且切割）。

• Q:

  雷霆系列限制性內切酶的穩定性如何？運輸過程中凍融會對酶的活力產生影響嗎？

  A:

  運輸過程中以干冰保持低溫運輸，酶有結冰的可能，但是這對于雷霆系列的限制性內切酶的質量沒有影響，我們對所有的酶都進行了至少三次的凍融實驗，檢測結果表示，酶的活性仍舊是100%。您收到的酶可能是冰袋運輸的，請不要擔心，這僅僅是由當地的經銷商運到您的實驗室過程中采取的運輸方案，我們經過嚴格的檢測，暴露在4℃下經過24~48 h后仍然不受影響。

• Q:

  除了高溫還有什么方法能夠讓雷霆系列限制性內切酶失活？（也不想用苯酚或氯仿）

  A:

  可以使用EDTA終止反應，或者以SDS等蛋白質變性劑使得酶變性。如果酶切產物還要用于下游實驗那么可以用膠回收試劑盒進行DNA清潔，回收后酶切反應就被終止了。

• Q:

  酶切反應完成后跑凝膠電泳，結果條帶與預期不符，可能原因有哪些？

  A:

  可能原因有如下幾個：

  　　•　限制性內切酶表現出星活性：確保酶切反應是嚴格按照說明書推薦的步驟進行的。如果是由星活性引起的那么有以下幾個解決方法：①減少反應時間；②增加反應體系的體積；③減少反應中酶的含量。

  　　•　酶切不完全（一個或多個酶切位點有部分DNA底物未被切開），可以嘗試加多酶量或者延長反應時間。如果上面的嘗試不能很好地解決問題，請從DNA底物上尋找解決方案，DNA底物中是否含有酶切反應抑制劑，將DNA純化后再進行反應；DNA是否被甲基化，胞內的甲基化系統能夠使DNA的特定堿基發生甲基化，而這些甲基化的堿基對于酶切反應有著不同程度的抑制。

  　　•　被未知限制性內切酶污染：未知的限制性內切酶可能通過不當的操作、不純凈的DNA底物、不潔凈的管子等途徑摻入酶切反應中。

• Q:

  有哪些關鍵因素會導致星活性？

  A:

  長時間孵育、過量的酶、高甘油含量（通常高于5%）、較小的反應體系等因素都會導致星活性的產生。

• Q:

  未經純化的PCR產物直接酶切要怎樣設定體系？

  A:

  反應體系推薦由這些內容組成：10 μl PCR產物、2 μl 10×CutOneTM Buffer、1~2 μl相應的限制性內切酶、ddH2O補齊到30 μl。酶的用量根據PCR產物的濃度而定，只加入2 μl反應緩沖液的原因是PCR反應中存在對應的鹽離子和金屬離子，適當減少反應緩沖液的用量以保證最終反應體系中的環境適宜限制性內切酶發揮功能。

• Q:

  雷霆系列限制性內切酶的活力定義是怎樣的？

  A:

  雷霆系列限制性內切酶1 U的定義是正好在15 min于20 μl的反應總體系中將1 μg的 DNA底物在1×反應緩沖液的環境中完全消化所需求的酶量。

• Q:

  雷霆系列限制性內切酶的活力單位與Thermo Fisher的活力單位或者 NEB的活力單位應該如何換算？

  A:

  由于反應時間，反應體系不同，活力單位無法直接換算。雷霆系列限制性內切酶活力單位是依據反應進行定義的，正好在15 min于20 μl的反應總體系中將1 μg的 DNA底物在1×反應緩沖液的環境中完全消化所需求的酶量為1 U，也就是說反應中加入與DNA底物成比例的酶量即可完成反應。