產(chǎn)品中心
LightNing? EcoRV
- EG15537S
5'...G A T ↓ A T C...3'
3'...C T A ↑ T A G...5'
產(chǎn)品介紹
LightNing® 快速內(nèi)切酶是一系列經(jīng)過基因工程重組的快速限制性內(nèi)切酶，適用于質(zhì)粒 DNA、PCR 產(chǎn)物或基因組 DNA 等的快速酶切。所有 LightNing® 快速內(nèi)切酶在通用的 CutOne® 或 CutOne® Color Buffer 中都具有優(yōu)良的活性，能夠在 5~15 分鐘內(nèi)完成酶切。此外，百時美去磷酸化、連接試劑在 CutOne® Buffer 中均具有 100% 活性，支持一管化反應(yīng)，提升“酶切 - 修飾 - 連接”的體驗。
CutOne® Color Buffer包括紅色和黃色示蹤染料，可將產(chǎn)物直接用于凝膠電泳。CutOne® Color Buffer 的紅色染料與 2500 bp 雙鏈 DNA 片段在 1% 瓊脂糖凝膠中遷移速率接近；黃色染料與 10 bp 雙鏈 DNA 片段在 1% 瓊脂糖凝膠中遷移速率接近。
產(chǎn)品組成
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組分 |
規(guī)格 |
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LightNing® EcoRV |
200 μl |
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10× CutOne® Buffer |
2×1 ml |
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10× CutOne® Color Buffer |
2×1 ml |
特性和用法
快速內(nèi)切酶，可在5~15 min內(nèi)完成反應(yīng)
建議反應(yīng)條件
1× CutOne®緩沖液；
37℃溫育；
參照“DNA 快速酶切流程”配制反應(yīng)體系。
失活條件
80℃溫育20 min。
甲基化敏感性
儲運(yùn)條件
-20℃
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相關(guān)問答
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Q:
為什么在CutOne® Buffer中加入HSA？
A:一些酶在反應(yīng)過程中需要HSA的參與，我們在CutOne® Buffer中添加了HSA，避免反應(yīng)中額外添加組分，使得酶切反應(yīng)更加便捷。
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Q:
HSA的添加對于雷霆系列限制性內(nèi)切酶的功能會產(chǎn)生什么樣的影響？
A:在我們的測試中未曾發(fā)現(xiàn)HSA對于雷霆系列限制性內(nèi)切酶的功能有任何影響。在有些情況下，對于部分的酶切反應(yīng)有促進(jìn)作用。
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Q:
為了保證酶量小于體系的1/10多酶切時往往可加入酶量較少，從而導(dǎo)致酶切不完全，如何解決？
A:說明書中給出的是最佳反應(yīng)體系，可以根據(jù)具體需求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
酶切不完全的問題可以從這幾個方面進(jìn)行解決：降低底物濃度，提高酶量同時擴(kuò)大反應(yīng)體系，或者適當(dāng)延長反應(yīng)時間。
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Q:
我需要嚴(yán)格遵守5~15 min的酶切時間嗎？能夠延長反應(yīng)時間嗎？
A:雷霆系列限制性內(nèi)切酶經(jīng)過改造可以將酶切時間縮短至5~15 min。同樣也消除了限制性內(nèi)切酶的星活性（長時間反應(yīng)造成的非特異性消化），在說明書中告知的星活性出現(xiàn)的時間范圍內(nèi)可以適當(dāng)延長反應(yīng)時間。
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Q:
酶切反應(yīng)完成后終止反應(yīng)是不是必要的？我該如何終止我的酶切反應(yīng)
A:限制性內(nèi)切酶對于下游反應(yīng)（連接與轉(zhuǎn)化等）有影響，部分限制性內(nèi)切酶能與雙鏈DNA結(jié)合，對于凝膠電泳會產(chǎn)生影響；而且不失活酶切產(chǎn)物不能保存。故反應(yīng)完成后應(yīng)對其進(jìn)行失活處理。常規(guī)失活方式為高溫?zé)崾Щ?，對?yīng)各個限制性內(nèi)切酶的失活溫度請查閱說明書。另，部分上樣染料中含有SDS可使蛋白變性，苯酚或氯仿的萃取也能使反應(yīng)終止。
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Q:
我什么時候應(yīng)當(dāng)考慮星活性對于酶切反應(yīng)的影響？
A:如果額外的酶切條帶對于實(shí)驗結(jié)果會產(chǎn)生影響時我們應(yīng)當(dāng)考慮星活性對于酶切反應(yīng)的影響。例如：進(jìn)行基因型、突變型分析或克隆時我們應(yīng)當(dāng)避免星活性的產(chǎn)生。避免星活性的有效方法：適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體積（較小的反應(yīng)體積容易造成甘油體積達(dá)到或超過總反應(yīng)體積的5%）；不進(jìn)行超長時間孵育（過夜消化極易產(chǎn)生星活性）。
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Q:
酶切反應(yīng)的具體操作流程是怎樣的？
A:大部分的科研工作者通常遵循如下流程：1 U限制性內(nèi)切酶可以完全酶切1μg經(jīng)過純化的DNA，總體積為20 μl于1×CutOneTM Buffer環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)。為防止總酶量超過總體積的10%，在雙酶切時可以適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體系。千萬不要孵育超過星活性出現(xiàn)的時間（星活性出現(xiàn)時間請查閱各酶說明書）。另外一個容易被忽略的問題對于酶切的影響也非常大，在反應(yīng)體系配制完成后完全的混勻才能反應(yīng)完全，推薦用槍頭輕輕吹打3到5次或用手指輕彈管壁，之后用離心機(jī)瞬離即可。不要渦旋反應(yīng)體系，劇烈震蕩對酶的活性有極大的影響。
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Q:
酶切反應(yīng)完成后，沒有看到切割后的跡象，有哪些因素可能對酶切產(chǎn)生抑制作用？
A:作為酶切反應(yīng)底物的DNA應(yīng)該是純凈的沒有污染的，其中例如：苯酚、氯仿、酒精、EDTA、去污劑、過量的鹽都會抑制酶切反應(yīng)。部分酶對于DNA的二級結(jié)構(gòu)較為敏感，DNA的缺刻、超螺旋都會對反應(yīng)產(chǎn)生影響。另外很多限制性內(nèi)切酶對于DNA的甲基化非常敏感，確保DNA的甲基化類型不會阻止限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)。如果找不到您的酶切反應(yīng)不能進(jìn)行的原因，我們推薦對照DNA底物（有多個酶切位點(diǎn)的DNA底物例如lambda DNA），進(jìn)行對比反應(yīng)。如果對照DNA底物能夠被切開而您的底物仍舊不能被切開，將兩種DNA底物進(jìn)行混合，進(jìn)一步確保DNA底物中不存在能夠抑制限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的物質(zhì)。
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Q:
超長時間的孵育（孵育時間超過1 h）對于酶切是否存在影響？
A:雷霆系列限制性內(nèi)切酶的酶活定義是以15 min反應(yīng)時間為標(biāo)準(zhǔn)的。增加反應(yīng)時間應(yīng)該對應(yīng)著減少酶的用量，值得注意的是不同的DNA底物對于酶的需求量是不一樣的。為了使DNA底物反應(yīng)完全同時避免非特異切割，使用前一定要仔細(xì)查閱酶的反應(yīng)濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、星活性出現(xiàn)時間等。
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Q:
限制性內(nèi)切酶簡并性識別位點(diǎn)一定是回文的嗎？
A:大多數(shù)二型限制性內(nèi)切酶的識別序列是回文的，而且是特定的堿基序列。然而有些限制性內(nèi)切酶具有簡并性識別位點(diǎn)，也就是說識別位點(diǎn)中有一個或以上的堿基對是非特異的（例如：BsrfI識別5’RCCGGY, R=A/G, Y=C/T）。對于這樣的具有簡并性識別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶，只要是符合要求的序列皆能被識別并且被正確地切割（例如5’ ACCGGC, 5’ ACCGGT, 5’ GCCGGC, 和5’ GCCGGT，其中兩個并不是回文的，仍然能被BsrFI識別并且切割）。
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Q:
雷霆系列限制性內(nèi)切酶的穩(wěn)定性如何？運(yùn)輸過程中凍融會對酶的活力產(chǎn)生影響嗎？
A:運(yùn)輸過程中以干冰保持低溫運(yùn)輸，酶有結(jié)冰的可能，但是這對于雷霆系列的限制性內(nèi)切酶的質(zhì)量沒有影響，我們對所有的酶都進(jìn)行了至少三次的凍融實(shí)驗，檢測結(jié)果表示，酶的活性仍舊是100%。您收到的酶可能是冰袋運(yùn)輸?shù)?，請不要?dān)心，這僅僅是由當(dāng)?shù)氐慕?jīng)銷商運(yùn)到您的實(shí)驗室過程中采取的運(yùn)輸方案，我們經(jīng)過嚴(yán)格的檢測，暴露在4℃下經(jīng)過24~48 h后仍然不受影響。
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Q:
除了高溫還有什么方法能夠讓雷霆系列限制性內(nèi)切酶失活？（也不想用苯酚或氯仿）
A:可以使用EDTA終止反應(yīng)，或者以SDS等蛋白質(zhì)變性劑使得酶變性。如果酶切產(chǎn)物還要用于下游實(shí)驗?zāi)敲纯梢杂媚z回收試劑盒進(jìn)行DNA清潔，回收后酶切反應(yīng)就被終止了。
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Q:
酶切反應(yīng)完成后跑凝膠電泳，結(jié)果條帶與預(yù)期不符，可能原因有哪些？
A:可能原因有如下幾個：
• 限制性內(nèi)切酶表現(xiàn)出星活性：確保酶切反應(yīng)是嚴(yán)格按照說明書推薦的步驟進(jìn)行的。如果是由星活性引起的那么有以下幾個解決方法：①減少反應(yīng)時間；②增加反應(yīng)體系的體積；③減少反應(yīng)中酶的含量。
• 酶切不完全（一個或多個酶切位點(diǎn)有部分DNA底物未被切開），可以嘗試加多酶量或者延長反應(yīng)時間。如果上面的嘗試不能很好地解決問題，請從DNA底物上尋找解決方案，DNA底物中是否含有酶切反應(yīng)抑制劑，將DNA純化后再進(jìn)行反應(yīng)；DNA是否被甲基化，胞內(nèi)的甲基化系統(tǒng)能夠使DNA的特定堿基發(fā)生甲基化，而這些甲基化的堿基對于酶切反應(yīng)有著不同程度的抑制。
• 被未知限制性內(nèi)切酶污染：未知的限制性內(nèi)切酶可能通過不當(dāng)?shù)牟僮?、不純凈的DNA底物、不潔凈的管子等途徑摻入酶切反應(yīng)中。
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Q:
有哪些關(guān)鍵因素會導(dǎo)致星活性？
A:長時間孵育、過量的酶、高甘油含量（通常高于5%）、較小的反應(yīng)體系等因素都會導(dǎo)致星活性的產(chǎn)生。
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Q:
未經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物直接酶切要怎樣設(shè)定體系？
A:反應(yīng)體系推薦由這些內(nèi)容組成：10 μl PCR產(chǎn)物、2 μl 10×CutOneTM Buffer、1~2 μl相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶、ddH2O補(bǔ)齊到30 μl。酶的用量根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度而定，只加入2 μl反應(yīng)緩沖液的原因是PCR反應(yīng)中存在對應(yīng)的鹽離子和金屬離子，適當(dāng)減少反應(yīng)緩沖液的用量以保證最終反應(yīng)體系中的環(huán)境適宜限制性內(nèi)切酶發(fā)揮功能。
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Q:
雷霆系列限制性內(nèi)切酶的活力定義是怎樣的？
A:雷霆系列限制性內(nèi)切酶1 U的定義是正好在15 min于20 μl的反應(yīng)總體系中將1 μg的 DNA底物在1×反應(yīng)緩沖液的環(huán)境中完全消化所需求的酶量。
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Q:
雷霆系列限制性內(nèi)切酶的活力單位與Thermo Fisher的活力單位或者 NEB的活力單位應(yīng)該如何換算？
A:由于反應(yīng)時間，反應(yīng)體系不同，活力單位無法直接換算。雷霆系列限制性內(nèi)切酶活力單位是依據(jù)反應(yīng)進(jìn)行定義的，正好在15 min于20 μl的反應(yīng)總體系中將1 μg的 DNA底物在1×反應(yīng)緩沖液的環(huán)境中完全消化所需求的酶量為1 U，也就是說反應(yīng)中加入與DNA底物成比例的酶量即可完成反應(yīng)。
