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  SDS-CN-EG15535-LightNing™ EagI

相關(guān)問答

• Q:

  為什么在CutOne® Buffer中加入HSA？

  A:

  一些酶在反應過程中需要HSA的參與，我們在CutOne® Buffer中添加了HSA，避免反應中額外添加組分，使得酶切反應更加便捷。

• Q:

  HSA的添加對于雷霆系列限制性內(nèi)切酶的功能會產(chǎn)生什么樣的影響？

  A:

  在我們的測試中未曾發(fā)現(xiàn)HSA對于雷霆系列限制性內(nèi)切酶的功能有任何影響。在有些情況下，對于部分的酶切反應有促進作用。

• Q:

  為了保證酶量小于體系的1/10多酶切時往往可加入酶量較少，從而導致酶切不完全，如何解決？

  A:

  說明書中給出的是最佳反應體系，可以根據(jù)具體需求進行適當調(diào)整。

  酶切不完全的問題可以從這幾個方面進行解決：降低底物濃度，提高酶量同時擴大反應體系，或者適當延長反應時間。

• Q:

  我需要嚴格遵守5~15 min的酶切時間嗎？能夠延長反應時間嗎？

  A:

  雷霆系列限制性內(nèi)切酶經(jīng)過改造可以將酶切時間縮短至5~15 min。同樣也消除了限制性內(nèi)切酶的星活性（長時間反應造成的非特異性消化），在說明書中告知的星活性出現(xiàn)的時間范圍內(nèi)可以適當延長反應時間。

• Q:

  酶切反應完成后終止反應是不是必要的？我該如何終止我的酶切反應

  A:

  限制性內(nèi)切酶對于下游反應（連接與轉(zhuǎn)化等）有影響，部分限制性內(nèi)切酶能與雙鏈DNA結(jié)合，對于凝膠電泳會產(chǎn)生影響；而且不失活酶切產(chǎn)物不能保存。故反應完成后應對其進行失活處理。常規(guī)失活方式為高溫熱失活，對應各個限制性內(nèi)切酶的失活溫度請查閱說明書。另，部分上樣染料中含有SDS可使蛋白變性，苯酚或氯仿的萃取也能使反應終止。

• Q:

  我什么時候應當考慮星活性對于酶切反應的影響？

  A:

  如果額外的酶切條帶對于實驗結(jié)果會產(chǎn)生影響時我們應當考慮星活性對于酶切反應的影響。例如：進行基因型、突變型分析或克隆時我們應當避免星活性的產(chǎn)生。避免星活性的有效方法：適當擴大反應體積（較小的反應體積容易造成甘油體積達到或超過總反應體積的5%）；不進行超長時間孵育（過夜消化極易產(chǎn)生星活性）。

• Q:

  酶切反應的具體操作流程是怎樣的？

  A:

  大部分的科研工作者通常遵循如下流程：1 U限制性內(nèi)切酶可以完全酶切1μg經(jīng)過純化的DNA，總體積為20 μl于1×CutOneTM Buffer環(huán)境下進行反應。為防止總酶量超過總體積的10%，在雙酶切時可以適當擴大反應體系。千萬不要孵育超過星活性出現(xiàn)的時間（星活性出現(xiàn)時間請查閱各酶說明書）。另外一個容易被忽略的問題對于酶切的影響也非常大，在反應體系配制完成后完全的混勻才能反應完全，推薦用槍頭輕輕吹打3到5次或用手指輕彈管壁，之后用離心機瞬離即可。不要渦旋反應體系，劇烈震蕩對酶的活性有極大的影響。

• Q:

  酶切反應完成后，沒有看到切割后的跡象，有哪些因素可能對酶切產(chǎn)生抑制作用？

  A:

  作為酶切反應底物的DNA應該是純凈的沒有污染的，其中例如：苯酚、氯仿、酒精、EDTA、去污劑、過量的鹽都會抑制酶切反應。部分酶對于DNA的二級結(jié)構(gòu)較為敏感，DNA的缺刻、超螺旋都會對反應產(chǎn)生影響。另外很多限制性內(nèi)切酶對于DNA的甲基化非常敏感，確保DNA的甲基化類型不會阻止限制性內(nèi)切酶的反應。如果找不到您的酶切反應不能進行的原因，我們推薦對照DNA底物（有多個酶切位點的DNA底物例如lambda DNA），進行對比反應。如果對照DNA底物能夠被切開而您的底物仍舊不能被切開，將兩種DNA底物進行混合，進一步確保DNA底物中不存在能夠抑制限制性內(nèi)切酶反應的物質(zhì)。

• Q:

  超長時間的孵育（孵育時間超過1 h）對于酶切是否存在影響？

  A:

  雷霆系列限制性內(nèi)切酶的酶活定義是以15 min反應時間為標準的。增加反應時間應該對應著減少酶的用量，值得注意的是不同的DNA底物對于酶的需求量是不一樣的。為了使DNA底物反應完全同時避免非特異切割，使用前一定要仔細查閱酶的反應濃度、反應溫度、反應時間、星活性出現(xiàn)時間等。

• Q:

  限制性內(nèi)切酶簡并性識別位點一定是回文的嗎？

  A:

  大多數(shù)二型限制性內(nèi)切酶的識別序列是回文的，而且是特定的堿基序列。然而有些限制性內(nèi)切酶具有簡并性識別位點，也就是說識別位點中有一個或以上的堿基對是非特異的（例如：BsrfI識別5’RCCGGY, R=A/G, Y=C/T）。對于這樣的具有簡并性識別位點的限制性內(nèi)切酶，只要是符合要求的序列皆能被識別并且被正確地切割（例如5’ ACCGGC, 5’ ACCGGT, 5’ GCCGGC, 和5’ GCCGGT，其中兩個并不是回文的，仍然能被BsrFI識別并且切割）。

• Q:

  雷霆系列限制性內(nèi)切酶的穩(wěn)定性如何？運輸過程中凍融會對酶的活力產(chǎn)生影響嗎？

  A:

  運輸過程中以干冰保持低溫運輸，酶有結(jié)冰的可能，但是這對于雷霆系列的限制性內(nèi)切酶的質(zhì)量沒有影響，我們對所有的酶都進行了至少三次的凍融實驗，檢測結(jié)果表示，酶的活性仍舊是100%。您收到的酶可能是冰袋運輸?shù)模埐灰獡模@僅僅是由當?shù)氐慕?jīng)銷商運到您的實驗室過程中采取的運輸方案，我們經(jīng)過嚴格的檢測，暴露在4℃下經(jīng)過24~48 h后仍然不受影響。

• Q:

  除了高溫還有什么方法能夠讓雷霆系列限制性內(nèi)切酶失活？（也不想用苯酚或氯仿）

  A:

  可以使用EDTA終止反應，或者以SDS等蛋白質(zhì)變性劑使得酶變性。如果酶切產(chǎn)物還要用于下游實驗那么可以用膠回收試劑盒進行DNA清潔，回收后酶切反應就被終止了。

• Q:

  酶切反應完成后跑凝膠電泳，結(jié)果條帶與預期不符，可能原因有哪些？

  A:

  可能原因有如下幾個：

  　　•　限制性內(nèi)切酶表現(xiàn)出星活性：確保酶切反應是嚴格按照說明書推薦的步驟進行的。如果是由星活性引起的那么有以下幾個解決方法：①減少反應時間；②增加反應體系的體積；③減少反應中酶的含量。

  　　•　酶切不完全（一個或多個酶切位點有部分DNA底物未被切開），可以嘗試加多酶量或者延長反應時間。如果上面的嘗試不能很好地解決問題，請從DNA底物上尋找解決方案，DNA底物中是否含有酶切反應抑制劑，將DNA純化后再進行反應；DNA是否被甲基化，胞內(nèi)的甲基化系統(tǒng)能夠使DNA的特定堿基發(fā)生甲基化，而這些甲基化的堿基對于酶切反應有著不同程度的抑制。

  　　•　被未知限制性內(nèi)切酶污染：未知的限制性內(nèi)切酶可能通過不當?shù)牟僮鳌⒉患儍舻腄NA底物、不潔凈的管子等途徑摻入酶切反應中。

• Q:

  有哪些關(guān)鍵因素會導致星活性？

  A:

  長時間孵育、過量的酶、高甘油含量（通常高于5%）、較小的反應體系等因素都會導致星活性的產(chǎn)生。

• Q:

  未經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物直接酶切要怎樣設(shè)定體系？

  A:

  反應體系推薦由這些內(nèi)容組成：10 μl PCR產(chǎn)物、2 μl 10×CutOneTM Buffer、1~2 μl相應的限制性內(nèi)切酶、ddH2O補齊到30 μl。酶的用量根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度而定，只加入2 μl反應緩沖液的原因是PCR反應中存在對應的鹽離子和金屬離子，適當減少反應緩沖液的用量以保證最終反應體系中的環(huán)境適宜限制性內(nèi)切酶發(fā)揮功能。

• Q:

  雷霆系列限制性內(nèi)切酶的活力定義是怎樣的？

  A:

  雷霆系列限制性內(nèi)切酶1 U的定義是正好在15 min于20 μl的反應總體系中將1 μg的 DNA底物在1×反應緩沖液的環(huán)境中完全消化所需求的酶量。

• Q:

  雷霆系列限制性內(nèi)切酶的活力單位與Thermo Fisher的活力單位或者 NEB的活力單位應該如何換算？

  A:

  由于反應時間，反應體系不同，活力單位無法直接換算。雷霆系列限制性內(nèi)切酶活力單位是依據(jù)反應進行定義的，正好在15 min于20 μl的反應總體系中將1 μg的 DNA底物在1×反應緩沖液的環(huán)境中完全消化所需求的酶量為1 U，也就是說反應中加入與DNA底物成比例的酶量即可完成反應。