限制酶種類知多少（上）
自從1968年科學家首次鑒定到限制性內切酶之后（見：限制酶的前世今生），目前已有4000多種限制酶蛋白被鑒定出來。從1975年NEB首次推出限制酶產品至今，各家公司也已有近400種限制酶產品上市，是生物醫學工具酶中最龐大的家族。面對如此琳瑯滿目的限制酶，您知道如何將它們分類么？
01 命名方式
限制性內切酶的名稱通常由其來源物種的分類決定，屬名首字母+種名前兩位字母+血清型/菌株+同菌株的多種限制酶流水號羅馬數字。
例如HindIII：
“H”代表屬名Haemophilus
“in”代表種名influenzae
“d”代表血清型d
“III”用于區分來自于Haemophilus influenza血清型d的其它限制性內切酶（如HindII和HindIII）。
又例如Eco57I：
“E”代表屬名Escherichia
“co”代表種名coli
“57”代表RFL57菌株
“I”用于區分來自于Escherichia coli RFL57菌株的其它限制性內切酶。
早期的限制酶名稱寫法要求用斜體書寫前面代表菌株來源的字母，空一格后再用正體書寫最后的羅馬數字流水號，如Hind III，目前這種寫法在部分中文期刊上還被沿用。現在國際上通行的寫法已經不再需要斜體和空格，直接用正體書寫即可。
02 分類依據
限制酶來源于細菌的“限制-修飾”(Restriction-Modification, R-M) 系統，是細菌免疫防御系統在胞內的第一道防線，是在噬菌體或其他入侵DNA尚未復制之前就降解其DNA。典型的R-M系統由限制酶 (REase) 和甲基轉移酶 (methyltransferase, MTase) 構成，通常成對出現，一般具有相同的DNA識別位點。限制酶識別雙鏈DNA上的特定序列并切割DNA，而甲基轉移酶對自身DNA同一識別位點上的腺嘌呤或胞嘧啶進行甲基化，保護自身DNA不被限制酶切割。通常情況下，含有R-M系統的細菌DNA在體內復制過程中被甲基化，而外來核酸（如噬菌體和質粒DNA）甲基化模式與細菌自身的甲基化模式不一致，能夠被細菌的限制酶識別并切割。
圖1 細菌利用“限制-修飾”系統抵御噬菌體入侵
因此，根據R-M系統的組成方式、DNA識別序列與切割位點特征、輔助因子需求等，可以將限制酶分為Type I、II、III、IV等4個大類。下面將分兩期詳細介紹限制酶的分類。
03 Type I
從第二個特點可以明顯看出，Type I限制酶難以產生確定的切割產物，不適合作為基因工程工具酶。常用的基因工程菌株都需要將編碼Type I限制酶的hsd基因突變失活，從而避免外源質粒被降解。
04 Type II
Type II限制酶又可劃分為諸多亞類，目前發現的亞類有：
圖2 Type IIP限制酶的亞基組成和切割模式
? Type IIS
Type IIS限制酶通常包含兩個結構域，或由大小兩個亞基組成，一個識別特異的DNA序列，一個負責水解磷酸二酯鍵。常用的Type IIS限制酶識別特定的非回文序列并在識別序列一側之外切割，對切割位點的序列沒有要求，因此與Type IIP不同，Type IIS酶切產物一個特定方向的末端可以完全不包含識別序列。這個特性決定了Type IIS限制酶在Golden Gate無縫克隆、mRNA疫苗環狀質粒模板線性化等場景中得到了廣泛應用。
圖3 Type IIS限制酶的亞基組成和切割模式
Type IIS還包含了所有的Type IIB、Type IIC和Type IIG亞類，因為這三個亞類的限制酶也是在識別序列之外切割DNA。
Type IIB限制酶的組成方式比較多樣，但都是在識別位點之外兩側 (both)固定距離的位置切割DNA，釋放一段包含識別位點的DNA短片段。Type IIB的識別位點中間往往還會包含一段非特異序列，例如BcgI ((10/12)CGANNNNNNTGC(12/10))。
圖4 Type IIB限制酶的亞基組成和切割模式
R：限制酶；M：甲基化酶；S：特異性序列識別結構域
Type IIC
因為切刻內切酶只切割DNA雙鏈中的一條鏈，所以在命名方式上與普通限制酶不同，需要在正常命名的名稱之前再加上Nt或者Nb的前綴，其中第一個字母N代表Nicking，第二個字母t表示切割“上面 (top)”那條鏈（如Nt.BspD6I: 5'-GAGTCNNNN↓N-3'），b表示切割“下面 (bottom)”那條鏈（如Nb.BbvCI：3'-GGAGT↑CG-5'）。
1. Loenen et al. (2014) Nucleic Acids Res, 42(1): 3-19
2. Loenen et al. (2014) Nucleic Acids Res, 42(1): 20-44
3. Pingoud et al. (2014) Nucleic Acids Res, 42(12): 7489-7527
