更精確的RNA分子剪刀來啦！

發(fā)布時(shí)間：2024-04-22 發(fā)布人：

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RNA內(nèi)切酶MazF —— RNA研究的新工具

小伙伴們已經(jīng)看我們發(fā)了好多關(guān)于限制性內(nèi)切酶的推文，有人會(huì)問了，你們天天在DNA上切來切去，有沒有工具能夠切RNA呢？這次我們就來向大家推薦一款可以在特定位置切割RNA的RNA內(nèi)切酶——MazF。

No.1 MazF

MazF是細(xì)菌Type II“毒素-抗毒素 (toxin-antitoxin, TA)”系統(tǒng)”（聽起來是不是跟“限制-修飾”系統(tǒng)很像呢）中的一種毒素蛋白 (toxin)；它還有個(gè)形影不離的伙伴叫MazE，是一種抗毒素蛋白 (antitoxin)。平時(shí)MazF與MazE緊密結(jié)合，毒性被抑制。當(dāng)收到外界脅迫等信號(hào)刺激時(shí)，MazF基因應(yīng)激過表達(dá)，或者M(jìn)azE蛋白降解，失去抑制的MazF蛋白開始切割mRNA，從而干擾（interfere）下游的一系列基因表達(dá)，產(chǎn)生細(xì)胞程序性死亡、細(xì)胞休眠等效應(yīng)，從而應(yīng)對(duì)外界脅迫。

圖1 Type II毒素-抗毒素系統(tǒng)

MazF是一個(gè)蛋白大家族，很多細(xì)菌中都含有這個(gè)家族的成員。最常見的MazF來源于大腸桿菌，特異性識(shí)別單鏈RNA中的ACA序列，最主要的切割位點(diǎn)是↓ACA，有時(shí)也會(huì)受上下游序列影響而變成A↓CA。

MazF對(duì)DNA和雙鏈RNA都沒有活性，如果RNA內(nèi)部形成了二級(jí)結(jié)構(gòu)，那么配對(duì)區(qū)域內(nèi)的ACA就不能被切割。此外，MazF對(duì)m6A甲基化敏感，甲基化的^m6ACA也不能被MazF切割。

圖2 MazF切割底物特征

MazF有兩個(gè)性質(zhì)與DNA限制酶存在顯著差別：第一，MazF水解RNA磷酸二酯鍵的反應(yīng)不依賴Mg²⁺，相反還會(huì)受Mg²⁺等二價(jià)金屬離子抑制。第二，MazF切割RNA的磷酸二酯鍵之后，形成的兩個(gè)末端分別是2’, 3’-環(huán)磷酸和5’-OH，產(chǎn)物不能直接用RNA連接酶重新連接。

No.2 MazF的應(yīng)用

1. 高分辨率m6A甲基化分析

傳統(tǒng)的高通量RNA m6A甲基化分析依賴于m6A抗體（如MeRIP-Seq），分辨率只能到100 – 200 nt，靈敏度、特異性、分辨率和樣品量都存在較大限制。利用MazF不能切割^m6ACA的性質(zhì)，中山大學(xué)駱觀正教授和以色列魏茨曼科學(xué)研究學(xué)院Schraga Schwartz教授在2019年分別獨(dú)立開發(fā)了非抗體依賴的m6A高通量分析技術(shù)，各自命名為m6A-REF-seq和MAZTER-Seq。

兩種技術(shù)采用相同的核心原理，都是用MazF來預(yù)處理mRNA，存在m6A修飾的ACA位點(diǎn)不會(huì)被切開，而沒有甲基化的同樣位點(diǎn)會(huì)被切開。然后將酶切后的片段建庫測序，與參考序列比較，切開和未切開的位置，測序分析獲得的豐度不一致，這樣就可以在全轉(zhuǎn)錄組水平上，以單堿基分辨率量化分析m6A甲基化水平。

圖3 MAZTER-Seq原理

此外，利用MazF和熒光定量PCR或基因芯片，也能夠量化分析特定位點(diǎn)的m6A甲基化水平。

圖4 m6A單堿基位點(diǎn)qPCR原理

2024年，復(fù)旦大學(xué)喬亮課題組又將MazF、滾環(huán)擴(kuò)增 (RCA) 和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-TOF MS) 結(jié)合起來，開發(fā)了一種新的檢測m6A甲基化的方法。該方法可以在大量非甲基化RNA存在的情況下準(zhǔn)確檢測低含量的甲基化RNA，且檢測限低，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

圖5 MazF-RCA結(jié)合MALDI-TOF MS檢測m6A甲基化原理

2. mRNA藥物序列分析

與大多數(shù)生物藥物一樣，序列分析也是mRNA藥物的一個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性。測序法雖然有效，但在生物制品的質(zhì)量表征中，往往需要多種方法正交以獲取更全面準(zhǔn)確的信息。高分辨率質(zhì)譜作為測序法的正交方法，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：無需擴(kuò)增直接分析核酸（避免測序過程中的錯(cuò)配），更高的檢測靈敏度，更短的分析時(shí)間，可直接檢測修飾核苷酸等。

質(zhì)譜分析mRNA序列的基本原理是，利用RNA酶將mRNA序列切割成短片段，然后用質(zhì)譜分析每個(gè)片段的質(zhì)量/電荷比，得到片段的精確分子量和二級(jí)碎片信息，從而獲得準(zhǔn)確的短片段序列和量化信息，再用“拼圖”的策略將這些片段拼接起來得到完整mRNA的信息。

由于核酸僅有4個(gè)特定堿基，組合形式遠(yuǎn)小于蛋白質(zhì)，因此需要酶解成較長的片段，以獲得可以覆蓋完整序列的特征片段。僅用特異性切割單鏈RNA上鳥嘌呤 (G) 的RNase T1，片段往往不能覆蓋全序列。這時(shí)聯(lián)合使用特異性更高的MazF等其他RNA內(nèi)切酶，就能獲得更好的mRNA mapping結(jié)果。